【佳學(xué)基因檢測(cè)】使用高通量基因篩選鑒定新的放射敏感性調(diào)節(jié)劑

放射療法的基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

電離輻射 (IR) 對(duì)人體的生物學(xué)影響不僅取決于輻射的物理特性和吸收劑量，還取決于受照射個(gè)體的獨(dú)特敏感性。IR 的一個(gè)關(guān)鍵目標(biāo)是 DNA，DNA 損傷反應(yīng)是一種保護(hù)機(jī)制，用于維持基因組完整性以應(yīng)對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激。未修復(fù)的 DNA 損傷會(huì)導(dǎo)致各種突變，從而對(duì)健康產(chǎn)生不利影響。細(xì)胞對(duì) IR 的敏感性與細(xì)胞修復(fù) DNA 損傷的能力高度相關(guān)，特別是影響該過(guò)程的基因的編碼序列以及有助于保持基因組完整性的其他基因的編碼序列。然而，正確分析個(gè)體敏感性背后的分子事件需要具有靈敏讀數(shù)的技術(shù)。在這里，我們總結(jié)了賊近使用全基因組分析并確定影響個(gè)體放射敏感性的基因的研究。雖然微陣列和 RNA-seq 提供了轉(zhuǎn)錄組的快照，但 RNA 干擾 (RNAi) 和 CRISPR-Cas9 技術(shù)是強(qiáng)大的工具，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)和表征涉及放射敏感性或放射抗性的特定基因的功能。值得注意的是，CRISPR-Cas9 已經(jīng)改變了基因組編輯技術(shù)的格局，因?yàn)樗岣吡藴?zhǔn)備性、精度和靈敏度。確定細(xì)胞放射敏感性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子將有助于定制提高治療效果和快速預(yù)測(cè)臨床結(jié)果的方案。它還將有助于基于平均個(gè)人敏感性的職業(yè)保護(hù)，

放療敏感性調(diào)節(jié)藥物及制劑研究關(guān)鍵詞

 放射敏感性，放射抗性，基因組編輯，CRISPR-Cas9，電離輻射

1. 放射敏感性調(diào)節(jié)藥物與制劑簡(jiǎn)介

在其一生中，人類可能會(huì)暴露于各種來(lái)源和劑量的電離輻射 (IR)，無(wú)論是來(lái)自診斷檢查（例如計(jì)算機(jī)斷層掃描和核醫(yī)學(xué)掃描）、環(huán)境和職業(yè)暴露，還是癌癥和其他疾病的治療. 無(wú)論暴露于低劑量或高劑量電離輻射（LDIR、HDIR），DNA 都是 IR 的主要細(xì)胞靶點(diǎn)。DNA 損傷反應(yīng)是一種保護(hù)機(jī)制，可維持基因組完整性以應(yīng)對(duì)各種形式的細(xì)胞應(yīng)激，包括 IR。如果不加以修復(fù)，DNA 損傷，尤其是 IR 誘導(dǎo)的 DNA 雙鏈斷裂 (DSB)，可能會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致體內(nèi)穩(wěn)態(tài)擾動(dòng)和傳播到后代細(xì)胞的有害后果。盡管已知輻射劑量和劑量率以及遺傳易感性和環(huán)境因素決定了細(xì)胞反應(yīng)的性質(zhì)和程度，但信號(hào)通路（例如，在 DNA 修復(fù)、氧化代謝或免疫反應(yīng)中）的作用仍不清楚和正在調(diào)查。識(shí)別這些途徑中涉及的分子事件將揭示決定放射敏感性的關(guān)鍵途徑中的新生物標(biāo)志物。本綜述總結(jié)了當(dāng)前的研究結(jié)果，使用高通量篩選技術(shù)，確定正常組織和癌細(xì)胞中的關(guān)鍵輻射抗性或敏感性調(diào)節(jié)劑，這些調(diào)節(jié)劑可用作治療靶點(diǎn)，也有助于個(gè)性化治療策略。

2. 輻射響應(yīng)

自 1895 年倫琴發(fā)現(xiàn) X 射線以來(lái)，已經(jīng)報(bào)道了對(duì) IR 的各種反應(yīng)。到 1906 年，患者的放射敏感性差異被認(rèn)為是影響 X 射線醫(yī)療應(yīng)用放射治療結(jié)果的主要因素之一. 然而，放射敏感性的定義近年來(lái)受到了挑戰(zhàn)。電離輻射獨(dú)立咨詢小組已將放射敏感性重新定義為衡量細(xì)胞或生物體反應(yīng)程度的指標(biāo)，而不是衡量 IR 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的指標(biāo)。此外，“抗輻射”是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中多個(gè)基因參與了防止損傷發(fā)生或修復(fù)或消除受損細(xì)胞的各種機(jī)制。癌細(xì)胞或正常組織的誘導(dǎo)輻射抗性也有助于細(xì)胞適應(yīng)隨后的環(huán)境挑戰(zhàn)（即IR），以及抵消氧化代謝的有害影響。

人類對(duì) IR 的反應(yīng)受各種因素的影響，例如年齡、吸煙、疾病和基因型。例如，一項(xiàng)針對(duì)乳腺癌患者的初步研究評(píng)估說(shuō)，放療 (RT) 引起的正常組織損傷的 81% 到 90% 的變化是由于患者的特定特征造成的。放射敏感性的這種變化部分受個(gè)體遺傳或表觀遺傳特征的影響。雖然輻射誘導(dǎo)的 DNA 損傷可以有不同的形式（即堿基修飾、單鏈斷裂和 DSB），但放射敏感性是細(xì)胞進(jìn)行特異性 DNA DSB 修復(fù)的能力 。DNA DSB 修復(fù)的兩個(gè)主要途徑是容易出錯(cuò)的非同源末端連接 (NHEJ)，它通過(guò)細(xì)胞周期被激活，以及同源重組修復(fù) (HRR)，它發(fā)生在 S 和 G2 后期。介導(dǎo)這些途徑的分子事件繼續(xù)被理解并為新發(fā)現(xiàn)提供了機(jī)會(huì)。主要在 HDIR的背景下研究了人群中 DNA 修復(fù)機(jī)制的細(xì)胞能力的個(gè)體差異。例如，突變的BRCA1/2基因攜帶者在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中都具有更高的放射敏感性。此外，頻繁暴露于診斷輻射可能會(huì)帶來(lái)問(wèn)題，尤其是對(duì)于在年長(zhǎng)時(shí)表現(xiàn)出不利健康影響的年輕人而言。暴露于累積劑量的 X 射線或 CT 掃描會(huì)顯著增加兒童患白血病或腦癌的風(fēng)險(xiǎn)。然而，個(gè)體放射敏感性的確切分子基礎(chǔ)，特別是在 LDIR 中，仍然知之甚少，放射敏感性的生物標(biāo)志物也難以捉摸。由于人類中有大量（超過(guò) 2 萬(wàn)個(gè)）基因，低通量研究可能無(wú)法有效篩選所有涉及放射敏感性的調(diào)節(jié)劑。相比之下，高通量分析提供了快速跟蹤的預(yù)測(cè)測(cè)試，并在輻射暴露的情況下為高危人群定制治療方案或公共政策。

3. 研究放射敏感性和抗性的高通量篩選方法

3.1. 基因表達(dá)分析（微陣列和 RNA 測(cè)序）

隨著關(guān)鍵“組學(xué)”相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，如 RNA 測(cè)序、微陣列、RNAi和 CRISPR-Cas9。高通量篩選可以識(shí)別特定表型的新基因或調(diào)節(jié)因子，并產(chǎn)生可以在低通量機(jī)制和功能研究中驗(yàn)證的新假設(shè)（圖1）。

圖1:個(gè)體放射敏感性研究的示意圖

使用高通量基因表達(dá)方法，一些研究已經(jīng)確定了影響對(duì)輻射反應(yīng)的基因。例如，郭等人在肺癌細(xì)胞中使用 DNA 微陣列分析。分析響應(yīng) IR的全局基因表達(dá)。一個(gè)微陣列包含數(shù)以千計(jì)的工程互補(bǔ) DNA (cDNA) 寡核苷酸，這些寡核苷酸被稱為與特定熒光標(biāo)記的 RNA 分子雜交的探針，并且可以同時(shí)檢測(cè)到不同已知轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。郭等人他們的分析重點(diǎn)是 2 個(gè)肺癌細(xì)胞系（NCI-H446 細(xì)胞與 A549 細(xì)胞）中 143 個(gè)基因的表達(dá)，這些細(xì)胞系對(duì)單次 5 Gy 劑量的伽馬射線具有不同的放射敏感性。與放射敏感性 NCI-H446 細(xì)胞相比，在放射抗性 A549 細(xì)胞系中，參與 DNA 修復(fù)機(jī)制的基因XRCC5、ERCC5、ERCC1、RAD9A、ERCC4和MDM2 的表達(dá)顯著增加。作者認(rèn)為，這個(gè)基因列表可能有助于使抗輻射肺腫瘤敏感。

執(zhí)行下一代 RNA 測(cè)序 (RNA-seq)，已經(jīng)對(duì)整個(gè)細(xì)胞群中響應(yīng) IR 的基因表達(dá)改變進(jìn)行了廣泛的研究。在尋找癌細(xì)胞對(duì) IR 反應(yīng)的預(yù)測(cè)因子時(shí)，Young 等人采用 RNA-seq 方法分析放射敏感性 LNCaP 和放射抗性 PC-3 前列腺癌細(xì)胞中的基因表達(dá)。他們?cè)诟吣?X 射線照射后 24 小時(shí)在兩種細(xì)胞系中確定了兩條具有相反反應(yīng)的典型途徑：DNA 修復(fù)途徑（LNCaP 中BRCA1、RAD51和FANCG的下調(diào)以及 PC-3 細(xì)胞中相反的模式）和細(xì)胞周期DNA復(fù)制途徑的控制（ORC1、CDC6的下調(diào)和在PC-3細(xì)胞中具有對(duì)比模式的MCM基因）。在另一項(xiàng)研究中，人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的整體基因表達(dá)在暴露于導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯的伽馬射線劑量后進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，促凋亡信號(hào)分子的失活和抗凋亡基因的晚期激活可能有助于膠質(zhì)瘤的放射抗性。深度測(cè)序用于描繪人類乳腺癌細(xì)胞對(duì) IR 的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的不同層。這項(xiàng)研究確定了對(duì) IR 有反應(yīng)的蛋白質(zhì)編碼基因和以前未識(shí)別的非編碼基因。因此，RNA-seq 允許對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行完整測(cè)序，而微陣列僅通過(guò)探針雜交分析預(yù)定義的轉(zhuǎn)錄本。在 RNA-seq 中，來(lái)自基因和基因變體（例如，剪接異構(gòu)體）的純化 RNA 被直接測(cè)序（無(wú)需探針的幫助）。因此，雖然微陣列和 RNA-seq 都可以顯示大量差異表達(dá)的基因，但 RNA-seq 揭示了對(duì)更廣泛基因表達(dá)的無(wú)偏篩選，具有更高的特異性和敏感性，包括新的、編碼的和非編碼的轉(zhuǎn)錄本。微陣列。

上一節(jié)中描述的批量 RNA-seq 分析通常測(cè)量細(xì)胞混合物中的轉(zhuǎn)錄物，這允許僅測(cè)量細(xì)胞群中的平均轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。這種傳統(tǒng)的測(cè)序方法無(wú)法分析稀有人群中發(fā)現(xiàn)的少量細(xì)胞，也會(huì)丟失細(xì)胞異質(zhì)性信息。單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 是一種創(chuàng)新的 NGS 方法，能夠以單細(xì)胞分辨率測(cè)量整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，并有助于了解單個(gè)細(xì)胞在其自然微環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄電路的變化。在兩項(xiàng)不同的研究中使用 scRNA-seq 方法來(lái)研究食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞 (ESCC) 的獲得性放射抗性。同樣，使用條形碼 Smart-seq2 技術(shù)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231 進(jìn)行和不進(jìn)行 IR 處理的 scRNA-seq 揭示了對(duì) IR 誘導(dǎo)的 DNA 損傷的異質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。scRNA-seq 數(shù)據(jù)分析還確定了輻射敏感性的潛在生物標(biāo)志物，包括參與 DNA 復(fù)制的MCM3、MCM4和SLBP基因。因此，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)有能力描繪不同癌癥類型對(duì) IR 的異質(zhì)反應(yīng)，從而改善治療選擇。

然而，盡管這些平臺(tái)已經(jīng)幫助識(shí)別了許多與放射敏感性有關(guān)的基因，但確切的機(jī)制仍不清楚。要了解該機(jī)制，先進(jìn)步也是賊重要的一步是檢測(cè)人群中的確切基因組變異。知道確切位置將允許探索轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和受影響的調(diào)節(jié)因子。然而，當(dāng)表型受多個(gè)基因（多基因模式）影響時(shí)，這是具有挑戰(zhàn)性的，與孟德?tīng)柲Ｐ拖喾?，孟德?tīng)柲Ｐ偷募膊∈怯沙Ｈ旧w或性染色體上的單個(gè)基因突變引起的。放射敏感性是一種數(shù)量多基因性狀，是細(xì)胞途徑之間相互作用的產(chǎn)物。出于這個(gè)原因，使用全基因組關(guān)聯(lián)研究 (GWAS) 是合適的，該研究已成功繪制出與疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的復(fù)雜性狀相關(guān)的數(shù)千個(gè)基因座和 DNA 序列變異。

3.2. 全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）

GWAS 檢查以單核苷酸突變形式呈現(xiàn)的變異。當(dāng)這些突變的頻率超過(guò)人口的 1% 時(shí)，它們被稱為單核苷酸多態(tài)性 (SNP)。在 SNP 的首批臨床研究之一中，Kerns 等人使用 GWAS 方法研究與勃起功能障礙相關(guān)的遺傳變異，作為前列腺癌患者放射治療 (RT) 后正常組織損傷的指標(biāo)。從 512,497 個(gè) SNP 的高通量分析中，rs2268363 位于編碼產(chǎn)物影響雄性性腺發(fā)育和功能的基因（FSHR基因），與 RT 的長(zhǎng)期副作用的發(fā)展密切相關(guān)。這有力地支持了使用 GWAS 方法探索正常細(xì)胞遺傳易感性與輻射損傷之間關(guān)聯(lián)的可行性。

此外，雖然輻射誘發(fā)的生殖系突變或受輻射父母子女的遺傳性疾病仍未得到證實(shí)，但已確定人類體細(xì)胞放射敏感性性狀可遺傳的有力證據(jù)。為了發(fā)現(xiàn)影響放射敏感性的基因和 SNP，Zyla 等人使用 GWAS 方法對(duì)人類雙胞胎進(jìn)行基因組分析，結(jié)果表明，響應(yīng)輻射的CDKN1A （細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 1A）表達(dá)中約有 66% 是可遺傳的。CDKN1A編碼蛋白質(zhì) p21，p53 的下游效應(yīng)子，是 DNA 損傷后細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和停滯的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。CDKN1A異常表達(dá)與對(duì)輻射的急性敏感性有關(guān)。此外，GWAS 允許鑒定與CDKN1A表達(dá)顯著相關(guān)的 SNP（即 rs205543（ETV6基因）、rs2287505 和 rs1263612（KLF7基因）參與CDKN1A轉(zhuǎn)錄因子、rs6974232（RPA3基因）、rs1133833（AKIP1基因）、和 rs17362588（CCDC141基因）是參與 DNA 錯(cuò)配和 RNA 修復(fù)的基因（總結(jié)于表1)。

表格1:對(duì)當(dāng)前抗輻射研究的摘要。

此外，黑腹果蠅遺傳參考小組 (DGRP) 是一個(gè)有價(jià)值的平臺(tái)，它允許對(duì)影響特定數(shù)量性狀的潛在基因、多態(tài)性或途徑進(jìn)行 GWAS 和作圖分析。使用這個(gè)模型，Vaisnav 等人發(fā)現(xiàn)了九個(gè)果蠅基因（如下所列并總結(jié)于表1) 與可能參與抗輻射的人類同源物。此外，作者發(fā)現(xiàn)了 32 個(gè)與輻射抗性相關(guān)的 SNP（在p < 10 ^{-5時(shí)，在}p < 10 ^-6時(shí)有兩個(gè) SNP）。在這些新的抗輻射候選者中，九個(gè)具有人類同源物，其功能實(shí)際上不參與修復(fù) DNA 損傷，突出了輻射抗性特征的其他機(jī)制的潛力：人類同源蛋白 ATP5J（ATP 合成），SLC 家族 35 成員 E1 （膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、凝血因子 II（凝血）、E3 泛素連接酶/SMURF2（泛素化）、蛋白質(zhì) VPRBP（細(xì)胞周期、端粒酶調(diào)節(jié)和組蛋白修飾）、轉(zhuǎn)錄因子 GATA-4（胚胎發(fā)生、心肌分化）、肌張力障礙/大皰性類天皰瘡抗原 1（細(xì)胞粘附）、LTrpC3/melastatin-2（鈣信號(hào)傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡）和 5'-核苷酸酶前體（腺苷產(chǎn)生）。

為了構(gòu)建更正確和有效的多基因風(fēng)險(xiǎn)模型，Oh 等人使用了數(shù)百個(gè) SNP，并開(kāi)發(fā)了一種稱為預(yù)處理隨機(jī)森林回歸的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，即使對(duì)于小的差異風(fēng)險(xiǎn) 也能發(fā)出信號(hào)。通過(guò)將這種新方法應(yīng)用于在單個(gè)機(jī)構(gòu)接受放療的 368 名前列腺癌患者的 GWAS 隊(duì)列數(shù)據(jù)集，該團(tuán)隊(duì)能夠識(shí)別假陽(yáng)性 SNP 并評(píng)估每個(gè) SNP（每個(gè) SNP 的關(guān)鍵生物學(xué)功能）在誘發(fā)放射性毒性結(jié)果。然而，GWAS 方法具有 Cano-Gamez 等人已經(jīng)明確討論過(guò)的缺點(diǎn)。。一個(gè)主要的挫折可能是缺乏對(duì)基因組非編碼區(qū)域中疾病相關(guān)基因座的作用的理解。由于它們?cè)诓煌?xì)胞類型或生理環(huán)境中基因表達(dá)調(diào)控中的作用仍不清楚，將 GWAS 研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床干預(yù)可能效率不高。此外，在 GWAS 或上述其他方法中找到的候選者需要進(jìn)行功能驗(yàn)證。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，RNAi 和 CRISPR-Cas9 等功能基因組學(xué)技術(shù)是分析基因功能的強(qiáng)大工具。

3.3. 全基因組 RNAi 篩選方法

RNA 干擾是一種強(qiáng)大的方法，用于對(duì)特定表型中涉及的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和關(guān)鍵途徑進(jìn)行功能喪失遺傳篩選。該方法已被用于敲除特定基因以研究癌細(xì)胞的放射敏感性。例如，Wang 等人使用全基因組 RNAi 篩選來(lái)尋找結(jié)直腸癌細(xì)胞（HCT116 和 HCT15 細(xì)胞）中的放射抗性基因。發(fā)現(xiàn)RFC4敲低顯著減輕 X 射線誘導(dǎo)的 DNA 損傷修復(fù)并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。RFC4 基因編碼的蛋白質(zhì)通過(guò)非同源末端連接 (NHEJ) 介導(dǎo)的途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中的細(xì)胞 DNA DSB 修復(fù)，因此 RFC4 上調(diào)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)（總結(jié)于表1)。此外，還有五個(gè)基因，包括 NCAPH（凝聚素復(fù)合物的調(diào)節(jié)亞基）、SYNE3（機(jī)械力在核包膜以及核運(yùn)動(dòng)和定位中的傳遞）、LDLRAD2（受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用）、NHP2（核糖體生物發(fā)生所必需的）和端粒維持）和FICD（ATP結(jié)合活性）也被確定為潛在的候選放射抗性基因。

赫爾等人使用相同的方法找到響應(yīng) IR 的同源重組修復(fù) (HRR) 特異性因子。由于在 HRR 過(guò)程中將使用完整的姐妹染色單體模板，因此該途徑為 DSB 提供了更正確和無(wú)錯(cuò)誤的修復(fù)（與 NHEJ 途徑相比）。作者將 CDC73（一種由HRPT2抑癌基因編碼的蛋白質(zhì)）鑒定為 HRR 的新調(diào)節(jié)因子。通過(guò)與 H2B 和 H3 的核心組蛋白相互作用，CDC73 優(yōu)化了 DSB 周圍的染色質(zhì)重塑，并支持 DNA 對(duì)下游修復(fù)元件和事件的可及性（總結(jié)于表1)。范哈夫滕等人將線蟲(chóng)秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露在 60 Gy 的輻射下，并使用全基因組 RNAi 技術(shù)鑒定了保護(hù)種系免受 DNA DSB 侵害所必需的八個(gè)基因。有趣的是，這些新發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)基因具有已知的人類直系同源物（即Y65B4BR.4A（人類：WWP2）、H19NO7.2a（人類：USP7、HAUSP）、Y41C4a.10（人類：TCEB2）、Y67D8C.5（人類：UREB1、LASU1）和C52D10.9（人類：SKP1A)) 預(yù)計(jì)將通過(guò)泛素化功能在蛋白質(zhì)的靶向降解中發(fā)揮作用。RAD51、組蛋白、CDC25A 和 p53，都在 DSB 反應(yīng)中發(fā)揮作用，受泛素化調(diào)節(jié)。這一觀察結(jié)果支持了某些蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白酶體活性激活或調(diào)節(jié) DSB 反應(yīng)途徑的觀點(diǎn)（總結(jié)于表1)。敲除這些基因提高了對(duì)電離輻射的敏感性并增強(qiáng)了染色體不分離。在另一項(xiàng)研究中，van Haaften 等人通過(guò)鑒定更多基因來(lái)擴(kuò)展他們的數(shù)據(jù)，這些基因是 DNA 損傷反應(yīng)和 RNA 加工和運(yùn)輸中的活性因子，這些基因有助于提高秀麗隱桿線蟲(chóng)中生殖細(xì)胞的放射敏感性。此外，發(fā)現(xiàn)新基因在整個(gè)動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中高度保守。在與人類同源基因中，已觀察到ATM、ITGA6、NIPBL、NOB1、CAND1/TIP120、WWP2和TopBP1 （總結(jié)在表1)。

盡管無(wú)論靶基因拷貝數(shù)如何，RNAi 都是通過(guò)下調(diào) mRNA 水平的基因表達(dá)來(lái)進(jìn)行全基因組篩選的強(qiáng)大工具，但其脫靶效應(yīng)也是不可避免的。事實(shí)上，通過(guò) RNAi 抑制基因表達(dá)可能不是有效的，這可能只會(huì)導(dǎo)致部分敲低。CRISPR 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)有效地解決了 RNAi 的許多這些缺點(diǎn)。

3.4. 全基因組 CRISPR-Cas9 篩選方法

從細(xì)菌免疫系統(tǒng)中采用的成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列 (CRISPR)-Cas 相關(guān)蛋白 9，稱為 CRISPR-Cas9，是一項(xiàng)有效改變基因組編輯和基因治療的新技術(shù)。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)包含兩個(gè)生物組件：RNA 引導(dǎo)的 DNA 內(nèi)切核酸酶 Cas9 和嵌合單引導(dǎo) RNA (sgRNA)。sgRNA 加載到 Cas9 上，并通過(guò)堿基配對(duì)定向到 DNA 靶標(biāo)上的 20 bp 區(qū)域。對(duì)于功能性基因編輯，目標(biāo) DNA 必須緊接在 5' NGG 序列之前（N 是任何核苷酸），稱為 protospacer 相鄰基序 (PAM)。Cas9 通過(guò)重定向到其目標(biāo)區(qū)域在目標(biāo)基因組位點(diǎn)誘導(dǎo) DSB 來(lái)促進(jìn)基因組編輯。然后細(xì)胞機(jī)制通過(guò) NHEJ 或 HRR 途徑修復(fù) DNA DSB。

該技術(shù)已被應(yīng)用于研究幾種基因（例如，Hsp70、骨橋蛋白和 HIF-1/2α）作為不同細(xì)胞系中放射抗性或放射敏感性特征的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子影響。為了開(kāi)發(fā)一種綜合方法并研究結(jié)直腸癌 (CRC) 細(xì)胞（RKO、HCT116 和 SW620）中的放射抗性調(diào)節(jié)因子，Yu 等人在陰性選擇篩選中應(yīng)用基因組規(guī)模的 CRISPR sgRNA 文庫(kù)來(lái)鑒定抗輻射候選基因。他們發(fā)現(xiàn) DNA 聚合酶 α 2 (POLA2)、含有自由基 S-腺苷甲硫氨酸結(jié)構(gòu)域 2 (RSAD2) 和 microRNA5197-5p (miR-5197) 在 IR 暴露后具有賊顯著的倍數(shù)變化。然而，進(jìn)一步的研究表明，與其他候選基因相比，miR-5197 的過(guò)表達(dá)在更大程度上損害了放射抗性。通過(guò)抑制細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白 CDK6 的表達(dá)并促進(jìn) G1/S 期細(xì)胞周期停滯，miR-5197 有助于 IR 誘導(dǎo)的 CRC 細(xì)胞凋亡（總結(jié)于表1)。然而，作者強(qiáng)調(diào)需要用體內(nèi)模型進(jìn)行進(jìn)一步研究來(lái)證明他們的發(fā)現(xiàn)。Ziyan 等人新穎在鼻咽癌 (NPC) 細(xì)胞中使用全基因組 CRISPR-Cas9 sgRNA 文庫(kù)，并對(duì)在陰性篩選中獲得的 sgRNA 進(jìn)行高通量測(cè)序。發(fā)現(xiàn) 9 個(gè)基因參與 NPC 細(xì)胞的放射敏感性或放射抗性。五個(gè)基因（BLN5、FAM3C、MUS81、DNAJC17 和 CALD1）被認(rèn)為是放射敏感性調(diào)節(jié)劑，而四個(gè)基因（CDKN2AIP、SP1、TOMM20和SNX22）似乎是潛在的放射抗性基因（總結(jié)在表1）。此外，對(duì) KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)的富集分析表明，這些基因通過(guò)范可尼貧血通路和 TGF-β 信號(hào)通路導(dǎo)致 NPC 的放射敏感性或放射抗性。通過(guò) CRISPR/Cas9 高通量篩選和負(fù)選擇可能與 NPC 的放射抗性有關(guān)的關(guān)鍵基因，Shen 等人還證明了LUC7L2的過(guò)表達(dá)通過(guò)自噬過(guò)程有助于放射抗性。LUC7L2 是一種 RNA 結(jié)合蛋白，尚未得到充分研究，僅在賊近幾年才被表征。

海曼等人使用電離輻射處理作為正選擇壓力，在 HNSCC 細(xì)胞系中進(jìn)行了全基因組 CRISPR-Cas9 篩選，以確定輻射敏感性的調(diào)節(jié)因子。多輪輻照后富集的 sgRNA 的陽(yáng)性篩選和 NGS 表明，刺激物或干擾素基因（稱為 STING，一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的信號(hào)分子）的激活會(huì)影響 HNSCC 細(xì)胞的輻射反應(yīng)。他們進(jìn)一步表明，STING 的藥理學(xué)激活可增強(qiáng)體內(nèi)電離輻射的作用，并且可能是增強(qiáng) HNSCC 患者放射治療反應(yīng)的有前景的方法（總結(jié)于表1）。在一項(xiàng)有趣的研究中，朱等人進(jìn)行了全基因組 CRISPR 激活篩選，并確定鈣調(diào)節(jié)熱穩(wěn)定蛋白 1 (CARHSP1) 是參與人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞放射抗性特征的必需元素（總結(jié)于表1)。由于其冷休克結(jié)構(gòu)域，CARHSP1 具有與單鏈 RNA、單鏈 DNA 或雙鏈 DNA 的多嘧啶區(qū)域結(jié)合的能力。因此，CARHSP1 可以與 DNA 結(jié)合并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄終止率，但它也具有調(diào)節(jié) RNA 穩(wěn)定性、mRNA 降解和核糖體翻譯的潛力。有趣的是，CARHSP1 增強(qiáng)了腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 的 mRNA 穩(wěn)定性，這是一種關(guān)鍵的多效性細(xì)胞因子和關(guān)鍵的炎癥分子。有了這些信息，朱等人表明升高的 CARHSP1 水平與通過(guò) CARHSP1/TNF-α 通路信號(hào)傳導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的放射抗性相關(guān)。程等人在 A549 肺癌細(xì)胞中使用無(wú)偏見(jiàn)的全基因組 CRISPR/Cas9 敲除策略，并確定 plakophilin 2 (PKP2) 是肺癌細(xì)胞抗輻射的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。程等人新穎表明甲基化 PKP2 蛋白促進(jìn) NHEJ 并增加肺癌的放射抗性。PKP2 的精氨酸甲基化由蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶-1 (PRMT1) 介導(dǎo)。因此，PRMT1 抑制也可能是使肺癌放射增敏的一種有吸引力的方法。

總而言之，這些研究表明，CRISPR/Cas 技術(shù)的應(yīng)用提供了一個(gè)無(wú)偏見(jiàn)的全局篩選以及參與 IR 誘導(dǎo)反應(yīng)的基因和途徑的綜合圖譜。

4.  放療基因組學(xué)會(huì)的討論意見(jiàn)

基因表達(dá)譜描述了同時(shí)測(cè)量許多基因或整個(gè)基因組的表達(dá)。它可以通過(guò)使用兩個(gè)主要平臺(tái)評(píng)估 mRNA 水平來(lái)完成：微陣列和 RNA-seq。追蹤在不同環(huán)境（例如，環(huán)境或壓力因素）中維持的不同細(xì)胞類型中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物譜給出了基因型與特定表型之間關(guān)聯(lián)的圖譜。與僅可以評(píng)估已知基因序列的表達(dá)的微陣列相比，RNA-seq 提供了“從頭”讀數(shù)，其中參考基因組或感興趣序列的先驗(yàn)知識(shí)不可用。然而，對(duì)于基因組具有多基因模式的表型，GWAS 放大了核苷酸變異和 SNP，以提供與復(fù)雜性狀相關(guān)的 DNA 序列的正確讀數(shù)。此外，強(qiáng)大的基因組工具（如 RNAi 和 CRISPR-Cas9）已實(shí)現(xiàn)對(duì)基因功能的全面分析。

RNAi 通過(guò)敲低基因的 mRNA 使基因沉默，而 CRISPR 通過(guò)靶向 DNA 序列產(chǎn)生基因敲除。盡管基于 RNAi 的篩選有助于破譯指導(dǎo)細(xì)胞放射敏感性的元素，但 RNAi 的實(shí)用性受到不完善的 mRNA 敲低、混淆脫靶效應(yīng)（引入噪音）的阻礙；這使得解釋表型變化變得困難，并將方法限制在轉(zhuǎn)錄基因上。此外，RNA 的引入可能會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)。CRISPR-Cas9 技術(shù)通過(guò)對(duì) DNA 進(jìn)行靶向修飾以實(shí)現(xiàn)有效基因敲除，有效地解決了許多這些限制，從而改變了基因編輯技術(shù)的格局。此外，

遺傳擾動(dòng)研究中的正篩選和負(fù)篩選都已用于輻射研究；但是，屏幕的目的和結(jié)果是不同的。負(fù)篩選用于尋找導(dǎo)致輻射抗性的基因，而正篩選用于尋找導(dǎo)致輻射敏感性的基因。在陰性篩選方法中，CRISPR 編輯的癌細(xì)胞接受亞致死劑量的輻射（可能殺死約 20% 的細(xì)胞）。與對(duì)照（CRISPR編輯但未用輻射處理）細(xì)胞相比，靶向參與介導(dǎo)輻射抗性的基因的sgRNA隨著時(shí)間的推移從群體中耗盡。在積極的屏幕上，CRISPR 編輯的細(xì)胞用致命劑量的輻射處理，使得靶向參與介導(dǎo)輻射敏感性的基因的 sgRNAs 在群體中隨著時(shí)間的推移而富集，并且可以在測(cè)序時(shí)被識(shí)別。可以同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性和陰性篩查，以分別使用特定的輻射劑量來(lái)識(shí)別放射抗性和放射敏感性的調(diào)節(jié)劑。此外，CRISPR 是一種多功能工具，不僅可以進(jìn)行功能喪失篩選，還可以進(jìn)行功能獲得篩選。CRISPR-Cas9 的功能增益應(yīng)用基于使用與轉(zhuǎn)錄激活劑融合的無(wú)核酸酶 Cas9 蛋白 (dCas9)，能夠快速有效地增加靶內(nèi)源基因的表達(dá)。類似地，可以通過(guò)將 dCas9 與轉(zhuǎn)錄抑制因子融合來(lái)執(zhí)行 CRISPR 抑制。

放射抗性和放射敏感性的全基因組研究都是在二維 (2D) 細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行的，這與腫瘤或正常組織的微環(huán)境不同。例如，二維癌細(xì)胞培養(yǎng)模型缺乏腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵特征，例如氧分壓、細(xì)胞間接觸改變、細(xì)胞基底膜粘附和重編程代謝。盡管二維細(xì)胞培養(yǎng)中的功能基因組學(xué)已經(jīng)產(chǎn)生了豐富的信息并發(fā)現(xiàn)了新的調(diào)節(jié)因子，但它們往往未能反映體內(nèi)的關(guān)鍵方面。例如，在 DepMap（一個(gè)使用基因組規(guī)模的 CRISPR 篩選在數(shù)百個(gè)細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)癌癥驅(qū)動(dòng)因素的項(xiàng)目）中，前 1000 個(gè)命中中 <1% 顯示出積極的生有效應(yīng)。此外，即使在二維結(jié)構(gòu)中維持的癌細(xì)胞中已知的腫瘤抑制基因失活，也常常導(dǎo)致陰性表型。因此，對(duì)在三維 (3D) 培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行全基因組篩選與體內(nèi)腫瘤微環(huán)境非常相似，是非?？扇〉摹ｍn等人研究了 3D 肺癌球體模型中的全基因組 CRISPR 篩選，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的敏感性不同于單層 2D 培養(yǎng)物的敏感性。由于 3D 球體模型更正確地概括了體內(nèi)腫瘤的微環(huán)境，Han 等人在使用 CRISPR 篩選時(shí)利用了這個(gè)模型（總結(jié)在表1)。此外，利用 CRISPR-Cas9 和 3D 細(xì)胞球體培養(yǎng)相結(jié)合的優(yōu)勢(shì)，Lan 等人檢測(cè)到 DYRK1A 作為胰腺癌細(xì)胞放射治療的敏感靶標(biāo)?；蛘?，可以在與生理?xiàng)l件相匹配的不同氧氣和代謝條件（例如缺氧或低葡萄糖）下進(jìn)行全基因組篩選以鑒定必需基因。

此外，為了獲得放射增敏和放射抗性基因的綜合圖譜，必須整合響應(yīng)各種輻射劑量的遺傳、轉(zhuǎn)錄和翻譯數(shù)據(jù)集。盡管一些研究人員已經(jīng)表明輻射誘導(dǎo)的基因表達(dá)高度依賴于單個(gè)細(xì)胞的基因型，但有證據(jù)表明，在翻譯水平進(jìn)行評(píng)估時(shí)，輻射誘導(dǎo)的基因表達(dá)與組織類型依賴性顯著相關(guān)[64, 65]。 斯塔克豪斯等人生成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (GBM) 患者衍生異種移植物 (PDX) 模型，并應(yīng)用新的生物信息學(xué)管道分析表型、轉(zhuǎn)錄組和全局激酶組（功能蛋白質(zhì)組）概況。通過(guò)進(jìn)行全外顯子組測(cè)序 (WES) 和深度 RNA-seq，作者提出，放射治療抗性等表型變化不僅在基因組水平上介導(dǎo)，而且主要在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平上介導(dǎo)。

此外，迄今為止進(jìn)行的基因篩查研究一直在使用 HDIR 來(lái)提高放射治療的有效性，例如，如何提高癌癥組織的放射敏感性。這與人們經(jīng)常暴露的對(duì) LDIR 的放射敏感性形成對(duì)比。此外，LDIR 不具有 HDIR 所具有的選擇壓力，并且響應(yīng) LDIR 的確切細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)機(jī)制和途徑尚不清楚。為了在 LDIR 的背景下找到正確的報(bào)告基因（例如 DNA 修復(fù)報(bào)告基因），CRISPR-Cas9 也可以成為一種強(qiáng)大的工具，可以全面分析 LDIR 暴露后激活的關(guān)鍵分子和途徑。

基因組編輯的賊新進(jìn)展使得能夠在不破壞 DNA 的情況下編輯 SNP，為研究與特定表型或疾病相關(guān)的遺傳變異開(kāi)辟了新途徑。例如，新一代堿基編輯器腺嘌呤堿基編輯器 (ABE) 能夠在活細(xì)胞中的目標(biāo)位點(diǎn)直接突變，而不會(huì)激活 DSB 損傷反應(yīng) 。該方法優(yōu)化了不需要的等位基因向納米致病等位基因的轉(zhuǎn)化，并以賊小的基因毒性影響實(shí)現(xiàn)了表型拯救[。使用主要編輯器系統(tǒng)，例如主要編輯指南 (pegRNA)，可以在目標(biāo)位點(diǎn)執(zhí)行任何局部突變和所需編輯（多達(dá)幾十個(gè)堿基對(duì)）。使用這些方法可以避免 CRISPR 基因剪刀技術(shù)的一些缺陷，包括不受控制的編輯結(jié)果混合、p53 激活和更大的 DNA 重排，使它們?cè)诜派浞雷o(hù)和放射敏感性研究的背景下成為安全和正確的方法。

總之，通過(guò)擴(kuò)大我們對(duì)放射遺傳學(xué)和細(xì)胞放射敏感性所涉及的機(jī)制的理解，我們可以識(shí)別出可以預(yù)測(cè)臨床結(jié)果的基因。有了這樣的預(yù)測(cè)，可以考慮對(duì)容易出現(xiàn)超放射敏感性的患者進(jìn)行替代治療。此外，如果在特定人群亞群中發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)大的風(fēng)險(xiǎn)差異，則可以提出更量身定制的保護(hù)系統(tǒng)來(lái)保護(hù)特定個(gè)體。

其他支持本文內(nèi)容的科技文獻(xiàn)：Int J Mol Sci . 2022 Aug 7;23(15):8774. doi: 10.3390/ijms23158774. Identification of Novel Regulators of Radiosensitivity Using High-Throughput Genetic Screening